皮下CDX荷瘤实验，这些关键点你注意到了吗？
在皮下CDX（细胞系来源异种移植）荷瘤实验中，成瘤效果受多重因素交织影响，涵盖细胞系固有特性、细胞状态、细胞传代次数、接种操作细节、小鼠品系与周龄、性别、饲养环境及适应期管理等。当荷瘤效果未达预期时，需系统性地逐项排查。这篇文章结合了实操经验，把几个关键点和容易踩的坑都整理出来了，希望帮助大家“少走弯路”。
影响实验效果的关键质控点
小鼠在运输过程中会产生应激反应，使小鼠出现一系列的病理生理学变化，这些变化会增加某些实验误差，因此在接到动物后应尽量避免立即进行实验，建议让动物有1~2周的适应期。免疫缺陷小鼠对饲养环境的要求高，必须饲养在SPF级屏障设施内，且与免疫正常小鼠饲养在不同房间。如果环境设施不达标，有可能会间接影响肿瘤模型的制备。裸鼠长期暴露在弱抗原的刺激下，NK等免疫细胞的活力逐步增强，会导致裸鼠对肿瘤的非特异性免疫力增强。
细胞状态：建议取处于对数期生长的细胞进行接种，避免体外过度传代影响细胞状态。
支原体检测：接种前对细胞进行支原体检测。支原体污染会改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态等，从而影响肿瘤生长和结果的可重复性[1]。
细胞活率：细胞活力是影响肿瘤形成的重要原因，建议接种前后均进行细胞活率检测，细胞活率90%以上为宜，确保接种过程中细胞活率没有明显降低。
细胞浓度：以活细胞数量为准，调整细胞浓度。
接种前
细胞混匀：接种前和接种过程中均需注意混匀细胞，接种前可使用1mL移液枪调至700-800μL对细胞悬液进行吹打，直至沉淀和絮状消失，接种过程中每次吸取细胞均要上下颠倒混匀。
添加基质胶（必要时）：建议提前一天将基质胶置于碎冰盒中，放置于4℃冰箱过夜融化；基质胶混匀，动作轻柔，避免过多气泡产生，且整个过程需放置在碎冰中。
细胞抽取：接种前活动注射器活塞，拔掉针头使用注射器头进行细胞吸取；套上针头排除气泡，使用平板纸擦拭注射器针头。
接种时
皮下注射：使用75%酒精消毒接种区域皮肤，于接种位置正下方进针，进针角度小于30°，进针过程中不要挑针，使针头平稳地在皮下移动，直至三分之一左右的针头进入小鼠皮下，缓慢注射细胞悬液，旋转出针。操作结束后注意观察注射部位是否有出血，小鼠是否活动异常等情况。
注意：整个接种过程建议在2h内完成；接种时细胞悬液应一直置于4℃环境中，使其维持恒定温度保证细胞活力；细胞接种后留取剩余细胞计数,建议细胞活率高于90%。
肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm3）=0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。由于不同实验人员测量之间可能存在误差，建议同一个实验中固定量瘤技术人员，以尽量避免肿瘤的测量误差。以下为AC米兰中文官方网站生物的肿瘤观察测量方式：
①小鼠保定，观察接种位置的肿瘤形态
保定时应使肿瘤周边皮肤相对松弛（下图1A、2A），避免肿瘤在保定过程中被拉扯变形（下图1B、1C、2B、2C）。同时注意保定小鼠头部及鼠尾，防止其回头咬伤实验人员。
图1. 以NCG小鼠为例，不同保定力度下肿瘤外观及形态示意图（A.松弛状态，B.拉伸状态，C.过度拉伸状态）
②酒精棉擦拭，清晰肿瘤形态
使用75%酒精棉球擦拭肿瘤表面及周边皮肤，使肿瘤轮廓更加清晰后进行肿瘤测量。注意：不应使用过于湿润的酒精棉球，以擦拭肿瘤表面后无明显液体为宜。测量时以肿瘤恰可以从游标卡尺外测量爪中通过的读数为准。
图2. 以NCG小鼠为例，酒精棉球擦拭后肿瘤形态（A.未擦拭，B.酒精棉球擦拭后）
关键点：
污染控制：不同细胞系、不同浓度细胞操作时注意更换耗材及手部消毒，避免污染
进针要点：进针过程中不压针、不挑针，保证针头平稳；注意进针角度
细胞浓度均匀：接种过程中注意细胞混匀，控制细胞接种时长，确保细胞活率
耗材更换：建议接种15-20只小鼠更换注射器，避免注射器针头磨损注射困难及注射器内死细胞过多
可能因素：
①细胞活率低，建议接种前后进行细胞活率检测并记录；
②接种剂量不足，建议梯度摸索接种剂量，也可尝试添加基质胶混合接种；
③注意排查操作过程是否存在漏液情况。
可能因素：
①细胞接种时注射器内有气泡未完全排干净；
②注射位置深浅差异，接种在肌肉内会导致生长速度过快；
③可能是某些癌种的特异性。
可能因素：
①肿瘤没长出来，前期观察到的不是肿瘤只是鼓包；
②肿瘤长的太快血供不足导致的肿瘤消退，可以尝试调整细胞剂量和接种部位；
③炎症反应导致肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察几周看肿瘤细胞吸收之后是否还能长起来；
④细胞系原因，细胞系如果有污染，后期的生长能力会下降，小鼠的免疫系统会消除肿瘤的生长；
⑤小鼠的免疫缺陷程度相关，该现象是肿瘤和免疫平衡的关系，可以尝试更换免疫缺陷程度更高的小鼠。
可能因素：
①环境因素：动物房是否为SPF级，同期是否有饲养其他免疫缺陷鼠；
②细胞或所用试剂是否有支原体或其他细菌病毒感染；
③接种方式：如尾静脉接种可能会出现由于引入空气带来的心脏栓塞导致的小鼠死亡；
④操作过程是否严格保持无菌；
⑤荷瘤后恶性细胞的快速增殖或浸润也可能会导致小鼠死亡。